背景[1-3]
HFF人正常皮肤细胞系是一种常用的实验细胞系，用于研究人皮肤细胞的生理和病理过程。这种细胞系由人正常皮肤细胞培养而来，具有上皮细胞样的形态和生物学特性。
HFF人正常皮肤细胞系通常用于各种生物学实验，如细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导、基因表达等。这些实验的结果可以用于研究各种皮肤疾病的病因和病理机制，以及开发新的治疗策略。
在使用HFF人正常皮肤细胞系进行实验时，需要注意细胞的保存和运输，以及细胞的生长特性和质量控制。同时，还需要根据具体的实验目的和要求，选择合适的实验方法和试剂，以确保实验结果的准确性和可靠性。
HFF人正常皮肤细胞系
HFF人正常皮肤细胞系细胞培养操作
1)复苏HFF人正常皮肤细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)HFF人正常皮肤细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)HFF人正常皮肤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
HFF人正常皮肤细胞系可以用于丝裂霉素对体外培养人正常皮肤成纤维细胞及Hacat细胞的作用及机制研究
探讨不同浓度的丝裂霉素对体外培养的HFF人正常皮肤细胞系及HaCat细胞形态、细胞增殖、生长特性及细胞凋亡等方面的影响,从而选取适当的作用浓度,研究该浓度的丝裂霉素作用于皮肤成纤维细胞后,细胞内caspase-3和caspase-8的表达,初步探讨丝裂霉素的凋亡诱导机制,以及成纤维细胞内细胞因子TGF-β1、bFGF与Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达变化,为局部应用丝裂霉素预防和治疗耳鼻咽喉术后皮肤纤维增生及瘢痕形成提供理论依据。
方法:体外培养HFF人正常皮肤细胞系及HaCat细胞,以0.04mg/ml、0.4mg/ml浓度的丝裂霉素及无血清培养基对照分别作用于这两种细胞5min,培养不同时程后采用倒置显微镜、细胞计数及MTT检测法观察两种细胞形态、增殖、生长特性与增殖抑制情况;采用AO/PI染色观察计数成纤维细胞的凋亡率;通过western blot法检测caspase-3的表达,免疫荧光法检测细胞内caspase-8活化及TGF-β1的表达;RT-PCR法检测细胞内TGF-β1、bFGF、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达情况。采用IPP图像分析软件和spssv15.0统计软件进行图片分析与统计学处理。
结果:HFF人正常皮肤细胞系及HaCat细胞呈指数生长;0.04mg/ml及0.4mg/ml浓度的丝裂霉素作用5min后能有效抑制HFF人正常皮肤细胞系及HaCat细胞的增殖,并使细胞增大变形、细胞间形态差异较大。0.04mg/ml浓度的丝裂霉素作用后第5天成纤维细胞呈现小幅增殖,对成纤维细胞的抑制强度明显低于0.4mg/ml浓度的丝裂霉素;两种试验浓度的丝裂霉素所致成纤维细胞的死亡形式主要为凋亡,0.4mg/ml浓度的丝裂霉素促凋亡作用明显强于0.04mg/ml浓度的丝裂霉素,两者比较差异有统计学意义(p<0.05)。0.4mg/ml浓度的丝裂霉素作用后前caspase-3表达先升高后降低,免疫荧光法检测到随培养时间的延长caspase-8活化片段的荧光强度逐渐增强,提示caspase-8的活化增多;0.4mg/ml浓度的丝裂霉素作用后,免疫荧光法检测细胞内TGF-β1蛋白表达变化不明显,但细胞内TGF-β1 mRNA却随培养时间的延长表达逐渐减少,bFGF mRNA的表达逐渐增高,Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达量则明显下降。
结论:0.04mg/ml和0.4mg/ml浓度的丝裂霉素能有效的抑制HFF人正常皮肤细胞系增殖,以0.4mg/ml浓度的丝裂霉素抑制作用较持久;丝裂霉素可以通过启动caspase凋亡途径,增加细胞凋亡;实验浓度的丝裂霉素可以从mRNA水平调节细胞因子TGF-β1、bFGF以及Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白的表达,从而减少细胞外机基质的合成,有效的抑制纤维增生瘢痕形成。但与此同时,丝裂霉素对HaCat细胞也有较强的增殖抑制作用,提示临床局部应用丝裂霉素预防和治疗耳鼻咽喉术后皮肤纤维增生及瘢痕形成时应注意保护表皮细胞,避免其毒副作用的影响。
参考文献
[1]A comparison of the local effectiveness of mitomycin C,aprotinin,and Adcon-L in experimental peridural fibrosis..Surgical Neurology,2008
[2]The Effect of Topical Mitomycin C on Full-Thickness Burns.Heath Tennyson;;Eric R.Helling;;Joseph Wiseman;;Edward Dick;;Robert C.Lyons.Plastic and Reconstructive Surgery,2007
[3]The Effect of ICG on Mitomycin C Cytotoxicity in Human Tenon Fibroblasts.Graham Reeves;;Richard Wallis;;Jonathan G.Crowston;;Keith M.Small;;Anthony P.Wells.Journal of Glaucoma,2007
[4]Application of mitomycin-C for head and neck keloids.Charles E.Stewart;;John Y.Kim.Otolaryngology-Head and Neck Surgery,2006
[5]王耀文.丝裂霉素对体外培养人正常皮肤成纤维细胞及Hacat细胞的作用及机制研究[D].中南大学,2010.