背景[1-3]
大鼠视网膜色素上皮细胞是一种常用的实验细胞，用于研究视网膜色素上皮细胞具有支持、营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。胞的生理和病理过程。这些细胞具有支持、营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。
在组织学上，视网膜分为10层，由外向内分别是：色素上皮层、视杆细胞层、视锥细胞层、外界膜、外核层、内界膜、内核层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。其中，色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞组成。
RPEC大鼠视网膜色素上皮细胞通常以T25培养瓶包装，容积75ml细胞数量可达10的6次方左右。这些细胞生长特性良好，活性高，存活率高，质量保证，没有细菌、真菌、支原体等微生物污染。
大鼠视网膜色素上皮细胞
大鼠视网膜色素上皮细胞培养操作
1)复苏大鼠视网膜色素上皮细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)大鼠视网膜色素上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)大鼠视网膜色素上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
大鼠视网膜色素上皮细胞可以用于八肽胆囊收缩素对高糖所致大鼠视网膜色素上皮细胞损伤的干预作用
应用不同浓度的八肽胆囊收缩素（Cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作用于高糖培养的大鼠视网膜色素上皮细胞，培养48小时后，MTT法检测细胞活力以及NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、及IL-6的表达的变化，根据结果筛选出CCK-8合适的治疗浓度，观察此浓度作用RPE细胞24小时、48小时及72小时上述因子的表达变化。
方法：1筛选CCK-8治疗浓度：培养大鼠视网膜色素上皮细胞，取对数生长期细胞进行实验，随机分为8组：①正常对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L）②高糖组（葡萄糖浓度：30mmol/L）③高渗对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L）④高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-5mmol/L）⑤高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-6mmol/L）⑥高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-7mmol/L）⑦高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-8mmol/L）⑧高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-9mmol/L），各组细胞应用同种培养液培养24小时后换成条件培养液，继续培养48小时，倒置显微镜下观察大鼠视网膜色素上皮细胞形态，应用MTT法检测不同浓度CCK-8对大鼠视网膜色素上皮细胞活力的影响，同时收集细胞标本，进行RT-PCR实验，检测NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6表达的变化。
2不同时间段CCK-8治疗浓度10-6mmol/L相关因子变化：根据MTT及RT-PCR的结果得出CCK-8的治疗浓度为10-6mmol/L，再次分组：①正常对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L）②高糖组(葡萄糖浓度：30mmol/L)③高渗对照组(葡萄糖浓度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L)④高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-6mmol/L），各组细胞分别培养24小时、48小时、72小时，取相应时间段细胞标本进行RT-PCR检测上述7种因子表达。
结果：1MTT法检测结果：与正常对照组比较，高糖组大鼠视网膜色素上皮细胞的活力明显降低（P<0.05），高渗对照组细胞活力未见明显改变；各不同浓度治疗组的细胞活力低于正常对照组，具有明显差异（P<0.05），CCK-8浓度为10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三组之间细胞活力无明显差异，三组与高糖组相比无明显差异，CCK-8浓度为10-6mmol/L与10-5mmol/L两组之间细胞活力无明显差异，但要高于其他三组治疗组和高糖组（P<0.05）。
2筛选CCK-8治疗浓度阶段RT-PCR结果：与正常对照组比较，高糖组NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6的表达上升（P<0.05），高渗对照组的表达未见明显差异。各不同浓度治疗组与正常对照组相比，其中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表达明显上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表达明显下降（P<0.05）。与高糖组相比，CCK-8浓度为10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三组中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表达上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表达下降（P<0.05），但是三组之间未见明显差异。CCK-8浓度为10-6mmol/L与10-5mmol/L两组之间未见明显差异，但与其他三组治疗组及高糖组相比，NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表达明显上升（P<0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表达明显下降（P<0.05）。
3不同时间段CCK-8治疗浓度10-6mmol/L相关因子变化：与正常对照组相比，高渗对照组7因子的表达未见明显差异；高糖组与正常对照组及高渗对照组相比，上述7种因子的表达明显上升（P<0.05）；与高糖组相比，治疗组NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1表达明显上升（P<0.05），48小时高于24小时及72小时（P<0.05），24小时及72小时之间无明显差异；与高糖组相比，治疗组TNF-α、IL-1α及IL-6表达下降（P<0.05），72小时的表达低于24小时和48小时（P<0.05），24小时和48小时间的表达无明显差异。
参考文献
[1]Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.Stuart G.Jarrett;;Michael E.Boulton.Molecular Aspects of Medicine,2012
[2]How does the macula protect itself from oxidative stress?.James T.Handa.Molecular Aspects of Medicine,2012
[3]Beneficial effects of the novel cholecystokinin agonist(pGlu-Gln)-CCK-8 in mouse models of obesity/diabetes.N.Irwin;P.Frizelle;I.Montgomery;R.Moffett;F.O’Harte;P.Flatt.Diabetologia,2012
[4]Age-related macular degeneration.Laurence S Lim;;Paul Mitchell;;Johanna M Seddon;;Frank G Holz;;Tien Y Wong.The Lancet,2012
[5]郝珍珍.八肽胆囊收缩素对高糖所致大鼠视网膜色素上皮细胞损伤的干预作用[D].河北医科大学,2014.