背景[1-3]
BV2小鼠小胶质细胞来源于1990年，应用携带癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒J2感染原代培养的小鼠小胶质细胞而获得的永生细胞系。免疫组化结果显示BV2为MAC1、MAC2阳性，而MAC3、胶质细胞原纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂为阴性。且是高度纯化的永生细胞系，同时该细胞系具备了原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点，相较于原代培养的细胞而言，永生化的细胞系培养起来更为容易。因此目前被广泛的运用于科研究当中。
BV2小鼠小胶质细胞
BV2小鼠小胶质细胞培养操作
1)复苏BV2小鼠小胶质细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)BV2小鼠小胶质细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)BV2小鼠小胶质细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
BV2小鼠小胶质细胞注意事项：
1.BV2小鼠小胶质细胞对培养条件较敏感，当培养基出现过酸或者过碱的情况时都会出现脱壁现象，尤其是在培养基过碱时，会出现快速脱壁的现象。因此在培养过程中需关注细胞培养基的酸碱度，当培养基颜色呈现粉紫色时，PH值大概率偏高，需及时收集培养皿中的悬浮细胞，进行离心换液，更换为新鲜的完全培养基。若使用的是培养瓶，应注意瓶口是否为透气瓶口，若不是带有透气口的款式，在使用时应拧松瓶口，保证瓶内CO2浓度为细胞正常生长所需浓度。
2.BV2小鼠小胶质细胞在培养过程中也会出现，圆形悬浮形态的越来越少，有触角的贴壁形态越来越多的情况。这种状况的出现往往也伴随着细胞增殖越来越慢甚至是停止生长的现象。这是因为相较于梭形细胞，圆形细胞的增值速度较快，因此在圆形细胞数量减少的情况下就会伴随出现增殖缓慢的情况。BV2为半贴壁半悬浮细胞，而圆形细胞大多数为悬浮形态，因此在换液及传代时应将细胞悬液收集，降低圆形细胞的损失。
3.BV2小鼠小胶质细胞易出现分化现象，分化后的细胞贴壁更牢，极难消化，因此应尽量缩短消化时间，预防细胞分化。若已经出现严重分化的情况，则可以尝试通过轻柔的吹打将部分细胞吹下来，并悬浮细胞一起收集，无法吹打下来的细胞直接舍弃，从而降低细胞的分化程度。但吹打时也要切记，不可暴力吹吸，避免对细胞造成机械刺激。
应用[4-5]
BV2小鼠小胶质细胞可以用于宽筋藤三种成分对LPS诱导BV2小胶质细胞神经炎症反应的影响
研究宽筋藤正丁醇部提取物Tinosinenside A(HD-1)、1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one(HD-13)、2-isopropyl-5-phenylmethyl-imidazolidinone-4-one(HD-17)对Aβ25-35损伤的PC12细胞保护作用,及抑制LPS诱导BV2小鼠小胶质细胞神经炎症反应的药效与机制研究。
方法:1、选取非甾体抗炎药为阳性参照,分子对接法预测HD-1、HD-13、HD-17抗炎靶点;2、以20μM Aβ25-35损伤PC12细胞24h为模型,MTT法检测HD-1、HD-13、HD-17作用后细胞存活率;3、HD-1、HD-17预防性给药4h,1μg/m L LPS刺激BV2小鼠小胶质细胞24h建立神经炎症模型。MTT法检测药物对BV2细胞活力影响;Griess法检测细胞上清液NO水平;Elisa法检测细胞上清液炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平;RT-PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、COX2、i NOS m RNA相对表达水平;Western blot法检测NFκB/NLRP3/Caspase 1通路靶点:NFκB P65、Phospho-NFκB P65、IκBα、Phospho-IκBα、炎性小体NLRP3/ASC/Caspase1、COX2、i NOS的相对表达。
结果:1、HD-1、HD-13、HD-17满足Lipinski类药性五规则,具有较好的类药性,且有较好肠道吸收和易透过血脑屏障。对接结合能ΔA HD-1﹤非甾体抗炎药平均结合能≈HD-17﹤HD-13,HD-1与NFκB/NLRP3/Caspase 1通路靶点对接结合能较低,且能形成较多利于稳定结合的氢键和疏水作用;
2、HD-1、HD-13、HD-17在10-200μM浓度区间对PC12细胞无毒性作用,与模型组相比HD-1在25-100μM浓度区间能提高PC12细胞存活率,而具有神经保护作用,HD-13、HD-17对PC12细胞存活率略有提高,但不具显著性差异;
3、HD-1、HD-17在12.5-200μM浓度区间或与1μg/m L LPS共孵育时对BV2小鼠小胶质细胞无毒性作用;HD-1、HD-17在50-200μM浓度区间能显著降低炎性介质NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,下调i NOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX2 m RNA相对表达,抑制NFκB/NLRP3/Caspase 1通路蛋白表达而发挥抑制神经炎症作用。
结论:分子对接结果显示宽筋藤正丁醇提取物HD-1可能具有较好的抗炎活性,且对NFκB/NLRP3/Caspase1炎症通路对接结合能较低、稳定结合可能性大;HD-1对Aβ25-35损伤的PC12细胞具有保护作用;HD-1、HD-17能显著降低LPS诱导BV2小鼠小胶质细胞神经炎症反应中炎性介质水平,下调炎性因子m RNA表达,可能通过抑制NFκB/NLRP3/Caspase1通路蛋白表达而发挥抑制神经炎症作用。
参考文献
[1]Alzheimer's disease drug development pipeline:2019.Jeffrey Cummings;;Garam Lee;;Aaron Ritter;;Marwan Sabbagh;;Kate Zhong.Alzheimer's&Dementia:Translational Research&Clinical Interventions,2019
[2]The NLRP3 inflammasome:molecular activation and regulation to therapeutics..Swanson Karen V;;Deng Meng;;Ting Jenny P-Y.Nature reviews.Immunology,2019
[3]NF-κB as a Key Mediator of Brain Inflammation in Alzheimer's Disease..Ju Hwang Chul;;Choi Dong-Young;;Park Mi Hee;;Hong Jin Tae.CNS&neurological disorders drug targets,2019
[4]Caspase-1 self-cleavage is an intrinsic mechanism to terminate inflammasome activity..The Journal of Experimental Medicine,2018
[5]何堃.宽筋藤三种成分对LPS诱导BV2小胶质细胞神经炎症反应的影响[D].江西中医药大学,2021.