背景[1-3]
C2C12小鼠成肌细胞是一种广泛应用于生物医学研究的连续鼠肌成纤维母细胞系。它由D.Yaffe和O.Saxel于1977年开发，最初来自粉碎损伤2小时后的2个月大的正常C3H小鼠股骨肌。这些细胞可以在高血清条件下迅速增殖，并在饥饿状态（低血清条件）下分化成肌肉束。肌肉束是收缩型骨骼肌细胞的前身，具有类似肌母细胞的形态。C2C12细胞系的分化很快，容易形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白。
在实验研究中，C2C12小鼠成肌细胞经常被诱导分化为多核肌管，这一过程是通过一种高度协调的序列程序来产生成熟的骨骼肌的过程。这种细胞系不仅是研究肌肉理想的细胞模型，也被广泛应用于其他领域如组织工程、再生医学等。
在实验中，为保证C2C12细胞的良好生长和分化，需要注意贴壁细胞生长到密度达70%时进行传代；不要让细胞长得太满甚至开始融合，这会影响后续成肌分化率；细胞消化完全后再吹打混匀，不要用枪头把没有消化好的细胞吹下来，以免细胞成团。
C2C12小鼠成肌细胞
C2C12小鼠成肌细胞(C2C12 mouse myoblasts)是一种常用的实验细胞系，来源于小鼠胚胎中的成肌细胞。这些细胞具有以下几个主要特点：
多能性：C2C12小鼠成肌细胞具有多能性，可以分化为骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞等多种细胞类型。
快速增殖：C2C12小鼠成肌细胞具有快速增殖的能力，可以在体外培养条件下快速扩增。
容易转染：由于其多能性和快速增殖的特点，C2C12小鼠成肌细胞易于进行基因转染和表达研究。
广泛应用于肌肉发育和疾病研究：由于其多能性和分化能力，C2C12小鼠成肌细胞广泛应用于肌肉发育和疾病研究，如肌肉萎缩症、心肌梗死等。
可用于药物筛选和毒性评价：由于其易于转染和快速增殖的特点，C2C12小鼠成肌细胞也可用于药物筛选和毒性评价。
C2C12小鼠成肌细胞培养操作
1)复苏C2C12小鼠成肌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)C2C12小鼠成肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)C2C12小鼠成肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
C2C12小鼠成肌细胞可以用于从PI3K/AKT信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对C2C12成肌细胞增殖及分化的机制
探讨龟鹿二仙胶含药血清通过调控PI3K/AKT信号通路影响下游指标caspase9干预C2C12成肌细胞增殖及分化的机制并探讨与细胞凋亡的相关性。
方法(1)配制龟鹿二仙胶以制备含药血清。选用8月龄SPF级SD大鼠60只制备龟鹿二仙胶含药血清,雌雄各半,体质量360-400 g并分别进行同样剂量的龟鹿二线胶及生理盐水的灌胃,后进行腹主动脉采血经离心、灭活操作后得到含药血清及空白血清。
(2) 实验室培养C2C12小鼠成肌细胞并探索其生长曲线,在其对数生长期用不同浓度的含药血清进行干预,同时观测其增殖。
(3) 设置对照组,空白血清组及含药血清组干预后进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况；
(4) 诱导C2C12小鼠成肌细胞分化,待其分化后检测目标myod、myog及caspase9的m RNA表达和myod、myog、p-akt、caspase9蛋白的表达情况。
结果：(1)10%龟鹿二仙胶含药血清相比空白血清及普通组促进成肌细胞增殖,各组间数据具有统计学意义(P<0.01)；
(2) 流式细胞仪结果显示10%含药血清对比普通组有效抑制细胞凋亡,但是和10%空白血清组相比,没有统计学意义。
(3) RT-PCR结果显示,与普通组相比较,空白血清组myod m RNA表达降低(P<0.01)、myog及caspase9m RNA表达升高(P<0.01或P<0.05),龟鹿二仙胶含药血清组myod、myog及caspase9m RNA明显升高(P<0.01或P<0.05)。与空白血清组比,龟鹿二仙胶含药血清组myod及myog m RNA表达较高(P<0.01)、caspase9 m RNA表达较低(P<0.01)。
(4) WB结果显示,与普通组相比较,空白血清组及龟鹿二仙胶含药血清组myod、myog、p-akt蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05)、caspase9蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05)。与空白血清组比,龟鹿二仙胶含药血清组myod、myog、p-akt蛋白表达较高(P<0.01或P<0.05)、caspase9蛋白表达较低(P<0.05)。
结论1.龟鹿二仙胶含药血清对C2C12小鼠成肌细胞有明显的促进增殖及分化作用;
2.龟鹿二仙胶含药血清可能通过激活C2C12小鼠成肌细胞的PI3K/AKT通路,活化AKT的表达,进而抑制凋亡相关基因caspase 9的表达,减少成肌细胞凋亡,从而产生影响。
参考文献
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[5]朱国涛.从PI3K/AKT信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对C2C12成肌细胞增殖及分化的机制[D].福建中医药大学,2021.