背景[1-3]
TMK-1人胃癌细胞系是一种来源于人类胃癌的细胞系，具有较高的增殖能力和侵袭性。这种细胞系通常用于研究胃癌的生物学特性、药物筛选和治疗策略等方面。
TMK-1人胃癌细胞系的建立始于1980年代，当时日本科学家从一名患有胃癌的男性患者身上获取了肿瘤组织样本，并成功地将其培养成了一种稳定的细胞系。该细胞系具有以下特点：
高度增殖：TMK-1人胃癌细胞系在体外培养条件下生长迅速，能够快速扩增。
高侵袭性：TMK-1人胃癌细胞系具有较强的侵袭性，能够在体外穿过人工基质并进入周围组织。
多药耐药性：TMK-1人胃癌细胞系对多种化疗药物表现出耐药性，这使得该细胞系成为研究多药耐药机制的重要模型。
TMK-1人胃癌细胞系已经被广泛应用于胃癌的研究中，包括以下方面：
胃癌的生物学特性研究：通过观察和分析TMK-1人胃癌细胞系的形态学、生长特性、基因表达等特征，可以深入了解胃癌的发生和发展机制。
药物筛选和评价：TMK-1人胃癌细胞系可以用于筛选和评价抗肿瘤药物的疗效和安全性，为临床治疗提供依据。
肿瘤转移机制研究：通过研究TMK-1人胃癌细胞系的侵袭性和转移能力，可以揭示肿瘤转移的分子机制和调控网络。
TMK-1人胃癌细胞系
TMK-1人胃癌细胞系细胞培养操作
1)复苏TMK-1人胃癌细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)TMK-1人胃癌细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)TMK-1人胃癌细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
TMK-1人胃癌细胞系可以用于siRNA靶向诱导肝素酶启动子甲基化对胃癌侵袭转移调控作用的研究
以肿瘤侵袭、转移相关性基因肝素酶为靶标，明确胃癌组织和胃癌细胞株中肝素酶启动子区域的甲基化状态，筛选出诱导肝素酶启动子甲基化的siRNA序列，并建立肿瘤特异性siRNA转导体系；在细胞和整体水平，明确靶向siRNA诱导肝素酶启动子甲基化及转录沉默对胃癌细胞侵袭、转移的调控作用，为运用表观遗传学方法调控胃癌的侵袭、转移提供全新的视野。
siRNA靶向干扰肝素酶启动子对胃癌中甲基化影响情况的研究目的研究siRNA干扰肝素酶启动子区域对胃癌中甲基化状态的影响情况，并筛选出诱导肝素酶启动子甲基化的siRNA序列，建立肿瘤特异性siRNA转导体系。
方法：构建靶向诱导肝素酶基因启动子区域甲基化及转录沉默的短发卡小干扰RNA(shRNA)表达质粒pGenesil-1，转染表达肝素酶的不同分化程度的胃癌细胞株MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、TMK-1人胃癌细胞系(低分化)，以实现对肝素酶表达的沉默，并对所设计不同位点序列siRNA进行筛选，为设计特异性siRNA转导体系和进一步探讨肝素酶在胃癌侵袭与转移中的作用打下坚实的基础。
结果：重组质粒测序结果与Genebank中的肝素酶基因cDNA序列相符，转染MKN-28、SGC-7901、TMK-1人胃癌细胞系细胞后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达；转染后甲基化PCR检测检测肝素酶启动子区域甲基化状态显示在site1、site2转染序列组细胞中均出现甲基化趋势，而在对照组中检测甲基化未见明显变化。TMK-1人胃癌细胞系和SGC-7901细胞在site1、site2转染序列组中均出现甲基化趋势，而MKN-28细胞则只在site2转染序列组中有甲基化趋势。而在其他转染序列组中均未见明显甲基化状态的改变。
结论：靶向肝素酶基因启动子区域诱导其甲基化shRNA表达载体构建无误，并针对不同甲基化位点筛选有效诱导肝素酶基因启动子区域甲基化的siRNA，随TMK-1人胃癌细胞系肿瘤细胞分化程度的降低，siRNA诱导其甲基化的频率升高，这为靶向特定性基因启动子区域CpG岛，而不是其编码区的siRNA能在人类细胞中诱导该基因DNA甲基化，并导致该基因在转录水平产生基因沉默提供了理论研究依据，为进一步阐明其作用机制建立了研究模型，并为将来高效精确靶向表观遗传调控基因表达奠定了一定的研究基础。
参考文献
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