背景[1-6]
高保真酶预混液是即用型2×预混合溶液，包含Hieff Canace®High-Fidelity DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系。Hieff Canace®High-Fidelity DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶，具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，其保真性是Taq DNA聚合酶的52倍，是普通Pfu DNA聚合酶的6倍。扩增速度可达15 sec/kb。适用于复杂模板的扩增，扩增产物为平末端。
高保真酶预混液是一种DNA扩增预混液，包含引物和模板之外扩增完全反应必需成分。适用PCR、NGS高通量测序文库等的扩增。预混液所含KAPA HiFi DNA Polymerase是新型改造B族DNA聚合酶，错误率比野生型Taq DNA聚合酶低约100倍，成功率和产率比野生型B族proofreading活性的DNA聚合酶更高。
2×Hieff Canace®PCR Master Mix具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可进行扩增，简化了实验操作步骤，减少了人为误差，提高了实验通量和结果的重复性。高保真酶预混液中不含染料，PCR产物需加入Loading buffer后进行电泳。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。
高保真酶是通过改造基因，筛选高活性的克隆进行表达；利用亲和层析、离子交换层析纯化而成。具有扩增能力强，扩增特异性高的特点。Easy、Trans、TransStart®系列PCR酶适用于各种不同要求的PCR。不同的模板由于其来源不同、GC含量不同、片段大小不同、扩增要求不同等诸多原因，对PCR酶的要求不同。高保真酶是一种新型B家族DNA聚合酶，经过工程改造后对DNA的亲和力增加，不需要辅助蛋白或DNA结合域。与野生型B家族DNA聚合酶相比，该酶固有的高持续合成能力可显著提高合成产量，速度和灵敏度。
此外，扩增长片段以及富含GC和AT片段的能力显著提高。该酶与特有抗体结合，次变性步骤之前可以保持失活状态。这可以防止反应过程中的非特异性扩增，提高灵敏度，并提高反应效率。
应用[7][8]
高保真酶预混液可用于基因克隆；复杂DNA模板扩增；高通量建库等实验中的PCR扩增：
高保真DNA聚合酶由聚合中心和酶切中心组成，聚合中心负责DNA聚合作用；而酶切中心负责发挥其3′→5′外切酶功能，对掺入的不配对碱基予以切除，以保证PCR产物的模板依赖性。由不能及时纠正或难于纠正的错配碱基引发的“关”闭DNA聚合反应，同样保证了DNA聚合反应成熟性终产物的保真度。而含有耐外切酶消化的硫代磷酸修饰的错配引物不能被3′→5′外切酶及时校正其错配碱基，导致了DNA聚合反应的非成熟性终止，从而构成了对SNP具有高度辨认能力的SNP敏感性复合分子“开／关”系统。
这一机制在很大程度上满足了后基因时代对SNP分析的要求。目的：探索高保真DNA聚合酶介导的SNP敏感性复合分子“开／关”在应用过程中的样品浓度检测范围、引物3′端硫代磷酸修饰个数和高保真酶活性三个条件，从而确定利用DNA聚合酶高保真原理检测SNP的最适条件，为SNP的检测提供新途径。方法：以质粒pDC316为样品，通过设计3′端与模板配对或不配对的硫代磷酸修饰引物，从样品浓度、引物3′端硫代磷酸修饰个数和高保真酶活性三个方面检测SNP敏感性复合分子“开／关”的准确性，分析出最适合的实验条件。
结果：研究中发现Pfu酶的“开／关”效应在引物3′端作一个硫代磷酸修饰时，仅在样品浓度为2ng／100μl或以下时能准确“关”闭含错配碱基的PCR反应；在引物3′端作两个硫代磷酸修饰时，在实验预设的样品浓度范围100-1ng／100μl内，都能准确“关”闭含错配碱基的PCR反应；在引物3′端作三个硫代磷酸修饰时，“开／关”效应出现假阴性结果。
Pyrobest酶介导的“开／关”效应在引物3′端作一个硫代磷酸修饰时不能准确“关”闭含错配碱基的PCR反应；在引物3′端作两个和三个硫代磷酸修饰时，均在样品浓度为10ng／100μl或以下时能准确“关”闭含错配碱基的PCR反应。Deep Vent酶介导的“开／关”效应在引物3′端作一个和两个硫代磷酸修饰时都不能准确“关”闭含错配碱基的PCR反应；
参考文献
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[2]Efficient mutagenesis method for producing the templates of single nucleotide polymorphisms[J].Jia Zhang,Kai Li,Zemin Deng,Duanfang Liao,Weiyi Fang,Xu Zhang.Molecular Biotechnology.2003(2)
[3]KRAS Mutation in Colon Cancer:A Marker of Resistance to EGFR-I Therapy[J].Ahmad D.Siddiqui,Bilal Piperdi.Annals of Surgical Oncology.2010(4)
[4]Understanding the pharmacogenetic approach to warfarin dosing[J].Ingrid Glurich,James K.Burmester,Michael D.Caldwell.Heart Failure Reviews.2010(3)
[5]Mutations in Both KRAS and BRAF May Contribute to the Methylator Phenotype in Colon Cancer[J].Takeshi Nagasaka,Minoru Koi,Matthias Kloor,Johannes Gebert,Alex Vilkin,Naoshi Nishida,Sung Kwan Shin,Hiromi Sasamoto,Noriaki Tanaka,Nagahide Matsubara,C.Richard Boland,Ajay Goel.Gastroenterology.2008(7)
[6]Superb nucleotide discrimination by a novel on/off switch for DNA polymerization and its applications[J].Kai Li,Jia Zhang,Linling Chen,Steve S.Sommer.Molecular Biotechnology.2005(2)
[7]Efficient mutagenesis method for producing the templates of single nucleotide polymorphisms[J].Jia Zhang,Kai Li,Zemin Deng,Duanfang Liao,Weiyi Fang,Xu Zhang.Molecular Biotechnology.2003(2)
[8]黎景光.DNA聚合酶高保真原理应用于SNP检测的研究[D].暨南大学,2006.