背景[1-6]
RLE-6TN大鼠肺上皮Ⅱ型细胞来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外著名大学建系。RLE-6TN大鼠肺上皮Ⅱ型细胞是上皮细胞样贴壁生长的细胞系。
细胞收到后操作流程：
1.收到细胞拿回实验室后，先打开外包装，用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，放到显微镜下观察细胞状态。因运输问题，细胞会有不同程度影响，先不要打开培养瓶盖，放到培养箱静置4小时左右，以便稳定细胞状态。
2.静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态(所拍照片作为后期售后依据)。建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。
3.贴壁细胞：若细胞生长密度超过80%时，根据情况传代，若细胞未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液移入废液缸中，原瓶（T25瓶）保留6-8ml完全培养液继续培养，直至细胞密度超过80%以后再进行传代。
4. 悬浮细胞：将细胞培养瓶内液体转移至离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，管底细胞沉淀加入10ml完全培养基吹打、重悬。放入新的细胞培养瓶/皿中培养过夜，根据细胞密度及生长情况分瓶传代。
细胞常规培养步骤（请严格遵守无菌操作）
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜），第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
弃去培养瓶中上清液，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加6ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。吹打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。
2、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心5分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
应用[7][8]
RLE-6TN大鼠肺上皮Ⅱ型细胞可用于细胞体外药物诱导实验：
香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)是否能诱导RLE-6TN细胞发生线粒体自噬,并进行了相关机制的初步探讨,为慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)的治疗提供新的思路。
研究方法：1.MTT比色法测定香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)对RLE-6TN细胞生长的抑制作用,确定CSE的最适刺激时间和浓度。2.透射电镜检测RLE-6TN细胞在CSE刺激下的线粒体形态变化。3.流式细胞术或多功能酶标仪定量检测方法检测RLE-6TN细胞线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)、细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平、线粒体内ROS水平及ATP的变化。4.Western blotting方法和免疫组织化学法检测LC3B、P62的表达水平。5.Western blotting方法检测细胞总蛋白和线粒体/胞浆蛋白中PINK1、Parkin、Drp1及Mfn2的表达水平。6.质粒EGFP-LC3B转染联合Mito-Tracker Orange荧光染色方法对RLE-6TN细胞在CSE刺激下LC3B与线粒体共定位情况进行观察。
参考文献
[1]Mitophagy in yeast:Molecular mechanisms and physiological role[J].Tomotake Kanki,Kentaro Furukawa,Shun-ichi Yamashita.BBA-Molecular Cell Research.2015(10)
[2]Autophagy receptor defects and ALS-FTLD[J].Veronika Majcher,Alice Goode,Victoria James,Robert Layfield.Molecular and Cellular Neuroscience.2015
[3]PARK2-mediated mitophagy is involved in regulation of HBEC senescence in COPD pathogenesis[J].Saburo Ito,Jun Araya,Yusuke Kurita,Kenji Kobayashi,Naoki Takasaka,Masahiro Yoshida,Hiromichi Hara,Shunsuke Minagawa,Hiroshi Wakui,Satoko Fujii,Jun Kojima,Kenichiro Shimizu,Takanori Numata,Makoto Kawaishi,Makoto Odaka,Toshiaki Morikawa,Toru Harada,Stephen L Nishimura,Yumi Kaneko,Katsutoshi Nakayama,Kazuyoshi Kuwano.Autophagy.2015(3)
[4]Mfn2 downregulation in excitotoxicity causes mitochondrial dysfunction and delayed neuronal death[J].Alejandro Martorell‐Riera,Marc Segarra‐Mondejar,Juan P Mu?oz,Vanessa Ginet,Jordi Olloquequi,Jeús Pérez‐Clausell,Manuel Palacín,Manuel Reina,Julien Puyal,Antonio Zorzano,Francesc X Soriano.EMBO J.2014(20)
[5]Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD[J].Mizumura,Kenji,Cloonan,Suzanne M,Nakahira,Kiichi,Bhashyam,Abhiram R,Cervo,Morgan,Kitada,Tohru,Glass,Kimberly,Owen,Caroline A,Mahmood,Ashfaq,Washko,George R,Hashimoto,Shu,Ryter,Stefan W,Choi,Augustine M K.Journal of Clinical Investigation.2014(9)
[6]Cadmium induces mitophagy through ROS-mediated PINK1/Parkin pathway[J].Xue Wei,Yongmei Qi,Xiaoning Zhang,Qian Qiu,Xueyan Gu,Chen Tao,Dejun Huang,Yingmei Zhang.Toxicology Mechanisms and Methods.2014(7)
[7]Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction[J].Lam,Hilaire C,Cloonan,Suzanne M,Bhashyam,Abhiram R,Haspel,Jeffery A,Singh,Anju,Sathirapongsasuti,J Fah,Cervo,Morgan,Yao,Hongwei,Chung,Anna L,Mizumura,Kenji,An,Chang Hyeok,Shan,Bin,Franks,Jonathan M,Haley,Kathleen J,Owen,Caroline A,Tesfaigzi,Yohannes,Washko,George R,Quackenbush,John,Silverman,Edwin K,Rahman,Irfan,Kim,Hong Pyo,Mahmood,Ashfaq,Biswal,Shyam S,Ryter,Stefan W,Choi,Augustine MK.Journal of Clinical Investigation.2013(12)
[8]]郭东方.香烟烟雾致RLE-6TN细胞损伤中线粒体自噬水平的变化及机制[D].兰州大学,2018.