背景[1-6]
大鼠原代脊髓神经元细胞分离自脊髓组织；脊髓是细细的管束状的神经结构，位于脊柱的椎管内且被脊椎保护；是源自脑的中枢神经系统延伸部分。中枢神经系统的细胞依靠复杂的联系来处理传递信息。脊髓的主要功能是传送脑与外周之间的神经信息。
人和脊椎动物中枢神经系统的一部分，在椎管里面，上端连接延髓，两旁发出成对的神经，分布到四肢、体壁和内脏。脊髓的内部有一个H形（蝴蝶型）灰质区，主要由神经细胞构成；在灰质区周围为白质区，主要由有髓神经纤维组成；脊髓是许多简单反射的中枢。脊髓两旁发出许多成对的神经（称为脊神经）分布到全身皮肤、肌肉和内脏器官。脊髓是周围神经与脑之间的通路，也是许多简单反射活动的低级中枢。按脊神经的出入可把脊髓也分为相应的31节，31对脊神经就是由不同的脊椎发出的。
神经系统最基本的结构和功能单位是神经元，即神经细胞，其大小和外观在中枢神经系统中差异很大。但都具有胞体和树突、轴突。胞体又叫核周体，内含神经丝、微管、内质网、游离核糖体和一个有明显核仁的核。一些大神经元突起的粗面内质网可用Nissl染色显示，在光镜下是灰蓝色斑块状，称为尼氏小体。树突和轴突是神经元的突起，能在神经元之间传递电冲动，突起的大小和形态各不相同，很难用常规的显微镜鉴别。脊髓组织内含有大量胶质细胞，神经元含量少，分离纯化难度大，且脊髓神经元细胞是高度分化的终末细胞，不能分裂增殖，培养要求高。
刚接种的脊髓神经元呈圆形，体积小，透亮，无突起。培养2-3d，可见胞体增大，突起增多延长；培养6-7d，细胞体大饱满，突起明显增加延长并交织成网，光晕明显，立体感强。培养20d后，死亡细胞明显增加，细胞出现内空泡，突起粗细不均，甚至脱壁，发生细胞崩解。
原代培养方法：取Wistar大鼠胎鼠或新生鼠的脊髓,以胰蛋白酶消化和机械吹打相结合,将组织分散成细胞悬液,培养于含10%胎牛血清和阿糖胞苷(抑制胶质细胞的增殖)DMEM培养基中,观察脊髓神经元细胞生长状况。结果3～6h细胞开始贴壁,胞体周围渐有突起;2～3d胞体明显增大,突起生长旺盛,连接呈网络;10d时细胞形态最为丰满;3周后细胞开始退化,胞内出现空泡。
细胞特性:
1)组织来源于实验动物的关节组织。
2)细胞鉴定：Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式：长梭状，不规则细胞，贴壁培养。
应用[7][8]
大鼠原代脊髓神经元细胞可用于肝细胞生长因子延长原代培养大鼠脊髓神经元的生存时间的研究：
肝细胞生长因子(HGF)对原代培养脊髓神经元的保护作用。方法原代培养脊髓神经元转染不同滴度的绿色荧光蛋白或肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-GFP or Ad-HGF),用流式细胞仪检测转染率,PI-Hoechst双染色观察神经元生长状况。用ELISA、中性红、MTT和NSE-ELISA等方法分别检测Ad-HGF转染脊髓神经元后HGF的表达,以及HGF对神经元的保护和迁移作用。
结果在转染复数(MO I)为50时,Ad-GFP可高效转染脊髓神经细胞,且细胞生长状态好。转染Ad-HGF后,HGF能有效表达,同时HGF作用后的神经元活性明显高于对照组(P<0.05)。并观察到HGF对脊髓神经元有明显促迁移作用。结论HGF对体外培养的脊髓神经元有保护和迁移作用。
参考文献
[1]Neuroprotective effects of ginseng total saponin and ginsenosides rb1 and rg1 on spinal cord neurons in vitro.B.Liao,H.Newmark,R.Zhou.Experimental Neurology.2002
[2]Localization and functional role of hepatocyte growth factor(HGF)and its receptor c-met in the rat developing cerebral cortex.Sun W,Funakoshi H,Nakamura T.Brain Research Molecular Brain Research.2002
[3]Adeno virus vectors for human gene therapy.Hitt MM,Graham FL.Advances in Virus Research.2000
[4]Establishment of neur onal in vitro models of ischemia in 96-well microtiter strip-plates that result in acute,progressive and delayed neu-ronal death.Meloni BP,Majda BT,Knuckey NW.Neuroscience.2001
[5]Inductions of hepatocyte growth factor and its activator in rat brain with permanent middle cerebral artery occlusion.Hayashi T,Abe K,Sakurai M et al.Brain Research.1998
[6]Hepatocyte growth factor reduces infarct volume after transient focal cerebral ischemia in rats.Tsuzuki N,Miyazawa T,Matsumoto K,et al.Acta Neurochirurgica Supplement.2000
[7]Evaluation ofneuronal cell death by laser scann ing cytom etry.Verdaguer E,,Pub ill D,R imbau V,et al.B rainRes B rain Res Protoc.2002
[8]刘铖,阙海萍,靳继德,刘少君,吴祖泽.肝细胞生长因子延长原代培养大鼠脊髓神经元的生存时间[J].基础医学与临床,2006(09):957-961.