背景及概述[1]
柴胡皂苷d（Saikosaponind，SSd）是从伞形科植物柴胡BupleurumChineseDC.和狭叶柴胡BupleurumscozonerifoliumWilld.干燥根中提到的一类皂苷单体成分，是柴胡主要化学指标和生物活性成份之一。现在研究表明，柴胡皂苷d的药理活性作用最强，具有解热、镇静、抗炎、抗菌、保肝、抗肾炎、调节免疫等药理作用。柴胡虽在《本经》中列为上品，历代本草也未将其列为有毒之品，但随着近年来在临床应用中不良反应报道日益增多，尤以日本柴胡中毒事件最为严重。关于柴胡使用安全性问题引起了人们的广泛关注，其中对于柴胡的毒性研究尤为严峻。在前期研究中发现，在“柴胡总皂苷粗提取物对小鼠急性毒性实验研究”中已初步证实柴胡总皂苷（Saikosaponin，SS）是导致柴胡产生毒性的主要成分群；在“柴胡总皂苷醇洗脱精制品对小鼠急性毒性的实验研究”中进一步证实了柴胡总皂苷是柴胡产生毒性的主要物质基础，所谓“精制”即是提高了柴胡皂苷a（SSa）和SSd的含量，为进一步验证柴胡皂苷类物质就是导致柴胡毒性的主要物质基础，获知其中标志性成分SSa和SSd的毒性信息，本研究进行了SSd对小鼠灌胃和腹腔注射两个途径的急性毒性研究。
药代动力学[2]
SSd属于环氧醚型五环三萜类齐墩果烷型衍生物，其分子式为C42H68013，分子量为780.96。有研究表明，小鼠腹腔注射SSd后，在血液和重要组织器官内都有分布，2h后血液浓度达到峰值；且在组织中分布有一定选择性，心、脑、脾等脏器中分布较多，但稳定性较差，多以其他形式存在。
药理作用[2]
1. 抗肿瘤、抗癌作用
研究证明，SSd可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用。诱导肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤细胞增生，抑制环氧合酶等。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）与肿瘤关系密切，可以通过促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤侵袭转移等多种机制参与肿瘤的发生及发展。在观察HIF-1α在人肝癌SMMC-7721细胞COX-2表达中的作用及柴胡皂甙d对其的影响的研究中发现，SSd在诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导凋亡的同时，能够明显下调其COX-2的mRNA及蛋白水平，降低COX-2活性，抑制PGE2的释放，提示SSd可能通过调节COX-2表达来发挥抗肿瘤作用，且此作用可能通过调节人肝癌细胞HIF-1α/COX-2、STAT3/ COX-2信号通路实现。SSd的抑癌作用可能与下调肝癌组织C-myc和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达有关。SSd可以通过影响大鼠的环氧合酶-2和CCAAT增强子结合蛋白β而发挥治疗作用。SSd能够改善肝功能，延缓肝癌发生，对实验性肝癌形成有一定的预防作用。SSd对人肝癌HepG2细胞的体外增殖有抑制作用，能使细胞周期中处于S期的细胞数减少。SSd可通过作用于血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-2（Ang-2）信号通路发挥抗癌作用。研究表明，SSd可明显抑制人宫颈癌Hela细胞系Survivin的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。SSd对人肺癌A549细胞的增殖具有明显的抑制、诱导凋亡的作用，可能通过bcl-2、C-myc基因表达的下调及Fas蛋白表达的上调实现。
2. 保肝、抗纤维化作用
肝纤维化是由于肝细胞慢性损伤、炎症和不断地组织重建，造成细胞外基质的大量分泌和广泛沉积所致。目前认为，肝星状细胞是肝脏生成细胞外基质的主要细胞，各种刺激因素通过细胞因子介导细胞信号通路激活肝星状细胞，使其大量增殖并发生表型转化分泌大量细胞外基质沉积于肝脏，是肝纤维化形成并发展到肝硬化的关键环节。在体外培养大鼠肝星状细胞，观察SSd对体外培养肝星状细胞增殖的抑制作用，结果显示，在一定范围内SSd对HSC增殖具有一定的抑制作用，且随着时间的延长，抑制效果明显升高。通过猪血清免疫法建立大鼠肝纤维化模型，证明了SSd较好的抗肝纤维化作用的作用机制可能与提高超氧化物歧化酶（SOD）活性、减少氧自由基的生成、抑制TGF-β1信号通路的活化有关。通过实验证实SSd可以明显改善肝功能，减轻大鼠肝组织的病理变化，减少肝脏细胞外基质透明质酸，层粘连蛋白，IV型胶原的含量，同时还可以明显的降低血液和肝组织中丙二醛（MDA）的含量、升高SOD的酶活力，提示在肝纤维化大鼠中，SSd有可能通过增强大鼠体内清除活性氧的能力和抗脂质过氧化来保护肝细胞免受损伤而防治肝纤维化，但是SSd抗脂质过氧化的具体机制仍不清楚。DangSS等[24]研究发现，SSd能减少四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化，可能与抑制肝中TNF-α、白细胞介素（IL-6）、核转录因子（NF-κBp65）的表达和增加NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）的活性有关。研究发现，SSd能够升高肝纤维化动物血清中的IL-10、一氧化氮（NO）水平和降低过高的TNF-α水平，还能够降低肝组织中转化生长因子β-1（TGFβ-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达，并调节血清中微量元素锌、钙的水平。有研究发现SS具有稳定细胞膜的作用，用自旋共振观察细胞膜流动性时，发现SS可使细胞膜的流动性下降；这种稳定细胞膜的作用是否与抗脂质过氧化有关，值得进一步探讨。
3. 治疗肾病作用
SSd在对抗肾小球基膜型肾炎、膜性肾病及系膜增生型肾炎的大鼠模型中有明显的治疗效果。王虹等[27]通过尾静脉注射兔抗鼠血清建立大鼠被动型Heymann肾炎模型，发现SSd可以降低被动型Heymann肾炎大鼠模型的尿蛋白，并对其生化指标具有改善作用，证明SSd对老年常见肾小球肾炎（膜性肾炎）大鼠模型的肾功能具有改善作用。SSd对狼疮鼠（NZBW）F1狼疮肾炎具有治疗作用，还能够有效地防治大鼠肾小球硬化，肾小球硬化是所有慢性肾脏疾病进行性发展至终末期的共同通道，最终可导致慢性肾功能衰竭。系膜细胞过度增殖及细胞外基质的过度生成和聚积是肾小球硬化早期的病理改变。早期治疗对于延缓或逆转肾小球硬化以减少终末肾的发生有着重要的意义。祖宁等[30]通过体外__培养、鉴定大鼠肾小球系膜细胞，初步证明SSd对的抑肾小球硬化制作用是通过抑制CDK4、e-Jun、c-Fos的表达实现的。
4. 免疫调节功能
实验研究发现RRX可以抑制IKK和Akt信号通路，下调NF-kB信号的表达，干扰NF-AT和AP-1（c-Fos）信号通路、细胞因子和IL-2受体表达，最终影响T淋巴细胞的活动。
5. 其他药理学作用
在研究SSd在小鼠体内是否具有类雌激素样作用时，发现SSd体外能够诱导雌激素受体（estrogenreceptor，ER）特异性荧光素酶报告基因表达，上调细胞ERmRNA及蛋白表达，以卵巢去势小鼠为动物模型，初步证明SSd在体内具有弱雌激素样作用，SSd可能是一种潜在的植物雌激素。通过动物实验发现，柴胡总皂苷和SSa具有抗电休克发作（MES）惊厥的作用，而SSc和SSd的抗MES惊厥作用不明显。
毒理学研究[2]
柴胡的毒性是在临床使用过程中逐渐发现的，因而对于SSd的毒性研究，也愈发受人关注。大量现代研究表明柴胡的有效成分和柴胡的毒性成分均为SS类成分，其毒性靶器官主要为肝脏。
1. 急性毒性
对SSd的急性毒性进行了研究，采用经典小鼠急性毒性实验方法，进行SSd对小鼠灌胃给药给药量和腹腔给药半数致死量的急性毒性研究，发现腹腔注射SSd的小鼠急性毒性大，毒性反应强烈，主要的毒性症状有躁动、走路不稳、心率加快、呼吸急促、间歇性抽搐等。
2. 慢性毒性
研究发现大鼠长期给予SS，可致肝功指标的改变，肝细胞器质性病变，并指出其导致大鼠肝毒胜损伤途径与氧化损伤机制密切相关。而SSd是柴胡中主要的皂苷类成分，也是柴胡主要的活性成分
3. 代谢毒性
研究证实人肠道中的真杆菌与双歧杆菌能水解SS，使之生成有活性的代谢产物，其可能有明显毒性。柴胡在动物体内的药代动力学研究提示SS在大鼠体内经肠道菌转化后才能被吸收和发挥其药效作用，依此可以推测体内代谢对SS所产生的毒性有一定影响。
4. 体外毒性
对人肝细胞L-02体外毒性机制探讨证实SSd具有较强的体外肝毒性，其机制并非只是诱导细胞凋亡，而是由于SSd诱导细胞膜通透性改变，从而导致细胞损伤甚至是坏死。
5. 其他毒性
SS不同的提取制备方式，其皂苷富集程度不一样，毒性大小也不一样。含SS量越高，其毒性越大。不同剂量的柴胡粗提物均能造成不同程度的肝损伤，主要表现为血液中总胆红素升高，说明胆红素代谢降低；血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶升高，表明肝脏细胞膜通透性增加；光学显微镜下，可观察到药物组大鼠肝细胞核固缩、嗜酸性变、肝细胞水肿等病理变化，同时肝体比值增加。同时，SS亦有溶血作用，其溶血强度为SSd>SSa>SSb1>SSb2>SSc。总之，关于SSd的毒性研究尚处于起步阶段，其导致毒性的具体靶点以及毒性机制和毒代动力学等都有待进一步的深入研究。
制备[1]
从柴胡中提取柴胡皂苷D的方法如下：
步骤一：将柴胡粉碎至40-60目，取100g柴胡粉末，加入柴胡质量5-8倍、质量浓度为75％-90％的乙醇，再加入乙醇与柴胡总重量0.5-3.3％的琥珀辛酯磺酸钠，得混合物；
步骤二：将混合物在超声波频率为40KHz、超声波功率为100-200W、温度为30-50℃的条件下超声浸泡20-40min，然后在微波反应器中用微波加热20-30分钟，微波功率为260-520W，频率为2450MHz，静置、冷却；
步骤三：重复步骤二一次，过滤，收集滤液和滤渣；
步骤四：向步骤三所得滤渣中加入200-400g质量浓度为80％的乙醇，再加入1.0-3.0g的琥珀辛酯磺酸钠；
步骤五：将步骤四的混合物在超声波频率为40KHz、超声波功率为100-200W、温度为30-50℃的条件下超声浸泡20-40min，然后在微波反应器中用微波加热20-30分钟，微波功率为260-520W，频率为2450MHz，冷却；
步骤六：重复步骤五一次，过滤，收集滤液；
步骤七：将步骤三和步骤六所得的滤液合并，然后在40-50℃的条件下在旋转蒸发仪上蒸去溶剂，加100-200ml水，搅拌，然后放置2小时，抽滤，将滤液用大孔树脂柱依次用水和质量浓度为60％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，然后将洗脱液在40-50℃的条件下在旋转蒸发仪上蒸干，得固状物，将固状物在真空烘箱内小于40-50℃的条件下干燥，得到柴胡皂苷粉末，经液相色谱分析所得柴胡提取物中柴胡皂苷D的含量。
主要参考资料
[1] 柴胡皂苷d对小鼠急性毒性实验研究
[2] 柴胡皂苷d药理与毒理作用研究进展
[3] CN201510030616.8从柴胡中提取柴胡皂苷D的方法