背景[1-3]
NG108-15[108CC15]小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞,原名108CC15。这个细胞株由小鼠N18TG2神经母细胞瘤细胞和大鼠C6-BU-1神经胶质瘤细胞在失活仙台病毒存在下融合而成。
细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌,培养条件:DMEM(高糖)+10%FBS;37℃,5%CO2。
NG108-15[108CC15]小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞
培养方法:
收到NG108-15(小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞)后,在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况:如果细胞未长满,用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内,严格无菌操作,打开细胞培养瓶,留10ml培养液继续培养。
如果细胞已长满(达80-90%)。即可进行传代,具体步骤如下:
1)弃去培养液,用PBS洗1-2次。
2)向瓶内加入1.0-2.0ml胰蛋白酶液,在倒置显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆,迅速拿回操作台,吸取胰蛋白酶,加含有6ml含10%血清的培养液,轻轻吹打细胞。
3)加入等量的的培养液,轻轻吹打混匀后吸出一半,分到新别的地方培养。4)传代比例:1:2-1:3
应用[4][5]
用于二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究
采用冈田酸诱导的NG108-15细胞制备阿尔兹海默病细胞模型,通过检测二苯乙烯苷对诱导的NG108-15细胞中磷酸化的Tau蛋白以及相关磷酸激酶和磷酸酶、磷酸激酶调控因子表达的影响,探讨二苯乙烯苷对阿尔兹海默病细胞模型Tau蛋白磷酸化调控的影响及作用机制。
方法:采用MTT法观察TSG作用于冈田酸诱导的NG108-15细胞24 h时的增殖情况,选取合适的剂量作为造模浓度。取对数生长期的NG108-15细胞,分为正常组、模型组、TSG低、中、高剂量(50、100、200μmol/L)组。
利用AO/EB双荧光染色法检测TSG对细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸激酶蛋白CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK,磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白的表达。RT-PCR法检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B mRNA的变化。
免疫荧光(Immunofluorescence)检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B和Tau蛋白表达和分布。采用SPSS软件对正常组、模型组和高、中、低给药组的Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白、磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β和磷酸酶蛋白PP2A、PP2B基因之间相关性进行分析。
结果:在MTT实验中,NG108-15细胞随OA浓度升高,存活率下降,当浓度为80nmol/L时,细胞存活率下降明显(P<0.01),细胞衰老皱缩,细胞形态学发生改变,AO/BE荧光染色显示细胞有凋亡产生。
选取80nmol/L作为造模剂量,经给药后,TSG能够增强冈田酸诱导的NG108-15细胞的增殖能力,呈一定的剂量依赖;与模型组比较,TSG能抑制冈田酸对NG108-15细胞的衰老,提高细胞存活率(P<0.05)。
TSG对OA诱导的NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中P-Tau的含量显著升高(P<0.01),TSG给药后与模型组相比,中、高剂量组P-Tau含量下降(P<0.01或P<0.05),免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少Tau蛋白的聚集。结果提示,TSG降低OA诱导的NG108-15细胞的Tau磷酸化水平,减少Tau蛋白的聚集程度。
参考文献
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[4]Tau in Alzheimer’;s Disease:Mechanisms and Therapeutic Strategies[J].Yu Gao,Lin Tan,Jin-Tai Yu,Lan Tan.Current Alzheimer Research.2018(3)
[5]谭俊杰.二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究[D].广西中医药大学,2019.