背景及概述[1]
L‑赖氨酸是人体必须氨基酸,是合成核蛋白、血红蛋白及合成脂肪酸代谢的重要载体‑肉毒碱的重要成份,还是促进大脑神经细胞再生的重要氨基酸,赖氨酸可增加胃蛋白酶及胃酸分泌,因此能促进老人及儿童的食欲。赖氨酸对营养不良、乙型肝炎、支气管炎等有一定的辅助疗效。赖氨酸与铁化合物一起,治疗贫血效果显著。
制备[1-3]
报道一、
(1)向L‑赖氨酸盐酸盐中加入纯化水(去离子水),L‑赖氨酸盐酸盐与纯化水的重量比为1∶1,混合均匀并完全溶解,放置待用;
(2)上柱吸附
将步骤(1)所得的溶解液按13L/分钟的流速,加入装有阳离子交换树脂的离子交换柱内,至树脂阳离子交换树脂全部吸附赖氨酸、且柱子的排出液内不含有赖氨酸,然后用纯化水通过交换柱内的树脂进行洗涤,洗至柱子的流出液中无Cl‑(此时流出液的pH为7);
(3)洗脱
然后用2mol/L的NH4OH(氨水)把L‑赖氨酸洗脱下来,NH4OH以13L/分钟的流速流经离子交换柱,当离子交换柱的流出液pH值上升至8.0时,流出液开始有茚三酮反应即L‑赖氨酸开始流出,收集流出液;当离子交换柱的流出液pH值上升至9.0~12时茚三酮反应颜色深,此时L‑赖氨酸含量高,洗脱至流出液无茚三酮反应即可停止收集;
(4)减压浓缩
将收集液在0.2Mpa、60~62℃减压浓缩赶氨,浓缩至原收集液体积的1/3时、加入此时浓缩液重量3.5%的活性炭进行脱色、过滤,冷却结晶,即得L‑赖氨酸。
采用电位滴定仪检测并计算的产物纯度为98.5%。
报道二、
游离L-赖氨酸固体的制备:称取1.00kgL-赖氨酸盐酸盐加入到5.0L纯化水中搅拌溶解澄清,然后将溶液加入到7.20kg活化后的强酸性阳离子交换树脂柱上,缓慢冲洗树脂柱,2-3h冲洗完,再继续用纯化水冲洗至中性和无氯离子(0.1mol/L硝酸银监测和广泛pH试纸)为止。用11.1kg5%v/v的氨水加入到树脂柱上,缓慢冲洗树脂柱2-3h左右,冲洗过程检测pH值大于10时,开始收集碱性洗脱液,直到pH值减小到10左右停止收集。将收集到的溶液在60℃(-0.10~-0.08Mpa)减压浓缩,浓缩出水和氨气,直到无液滴滴出,继续浓缩变成白色固体,向体系中加入8L的无水乙醇,继续打浆析晶,打浆3h,析出所有固体,离心过滤出固体,直到无液滴滴出,将滤饼平铺到搪瓷托盘,真空干燥(60±5℃,-0.08~-0.1Mpa)8h,将产品冷却室温,装入密封袋密封阴凉处保存,得到游离L-赖氨酸固体776g,收率96.95%,纯度:99.62%,HNMR(D2O):3.223-3.188(CHN)、2.848-2.794(2H/CH2N)、1.542-1.523、1.276(-CH2CH2CH2-)。LCMS(M+1):147.1127。
报道三、
L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下:
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾1.5g/L,硫酸铵9g/L,酵母浸粉5g/L,苏氨酸0.5g/L,蛋氨酸0.5g/L,味精7g/L,丙酮酸钠0.5g/L,醋酸钙1g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基,用20%(体积比)氢氧化钾溶液调节pH值为6.0,通水蒸气将培养基升温至121℃,灭菌20min,开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌300rpm,按照通风比1:0.4通入无菌空气,调节罐压为0.05Mpa,并用氨水调节pH至6.7并维持恒定,校溶氧100%。
将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养,培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50%,培养10h后,每隔2h取样镜检并测总糖,当镜检菌体形态正常且总糖下降至10g/L时停止培养,得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖70g/L,硫酸镁1g/L,磷酸二氢钾1g/L,硫酸铵10g/L,玉米浆水解液1g/L,毛发水解液1g/L,甜菜糖蜜10ml/L,苏氨酸0.4g/L,蛋氨酸0.4g/L,醋酸钙2g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基,用氨水调节其pH值为6.2,通水蒸气将培养基升温至121℃,灭菌20min,开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm,按照通风比1:0.4通入无菌空气,调节罐压为0.05Mpa,用氨水调节pH值为6.6并维持恒定,校溶氧100%。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2%接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养,培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50%,培养10h后,每隔2h取样镜检并测还原糖,当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8g/L时停止培养,得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸0.3/L,硫酸铵9g/L,玉米浆水解液0.5g/L,毛发水解液0.5g/L,甜菜糖蜜10ml/L,甜菜碱0.5g/L,醋酸钙1g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基,用20%氢氧化钾调节其pH指为5.6,通水蒸气将培养基升温至121℃,灭菌20min,开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌400rpm,按照通风比1:0.3通入无菌空气,调节罐压为0.07Mpa,用氨水调节pH值为6.7并维持恒定,校溶氧100%。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10%接到赖氨酸发酵培养基中进行培养,培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40%。
培养过程中每2h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度,当发酵液中的还原糖浓度下降至4g/L时,开始流加60%(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4g/L左右,当发酵液中的氨氮浓度下降至1g/L时,开始流加40%(m/v)硫酸铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1g/L左右。
参考文献
[1][中国发明]CN201110456105.4L-赖氨酸的制备方法
[2][中国发明]CN202010925450.7一种游离L-赖氨酸固体的制备方法
[3][中国发明]CN201611239506.3一种L-赖氨酸的发酵方法