背景[1-3]
U-2 OS人骨肉瘤细胞是由Ponten·J和Saksela·E在1964年从一名15岁女孩的胫骨中等分化的肉瘤中分离建立的。U-2 OS细胞与WI-38细胞共培养或用抗猴空泡病毒SV40、呼吸道合胞病毒RSV或腺病毒的补体结合试验(CF法)未检测到病毒。U-2 OS细胞表达胰岛素样生长因子I、II(IGF-I、IGF-II)受体和骨肉瘤衍生生长因子(ODGF)。生长培养基 ：McCoy's 5A＋10%FBS＋1%P/S；培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%；温度：37℃。
U-2 OS人骨肉瘤细胞
细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S；
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于IGF-1R抑制剂PPP对人骨肉瘤细胞U-2OS的影响及其机制的研究
观察IGF-1R特异性抑制剂PPP对人骨肉瘤细胞U-2OS的影响,并初步探讨其抗骨肉瘤转移可能的机制。
方法:1.应用MTT方法检测不同药物浓度、不同干预时间对人骨肉瘤细胞U-2OS生长增殖的影响,并在镜下观察细胞形态学变化、照相;
2. PPP处理细胞24h后,流式细胞术检测骨肉瘤U-2OS细胞的周期变化;
3. 划痕愈合实验和Transwell方法测定PPP对骨肉瘤细胞U-2OS迁移和侵袭能力的影响;
4. 使用Western blot方法观察PPP对肿瘤细胞EMT标志物E-cadherin、Vimentin表达水平的改变。
结果:1.在倒置相差显微镜下观察IGF-1R抑制剂PPP处理后的细胞,显示随着药物浓度的升高或作用时间的延长,骨肉瘤细胞U-2OS生长缓慢,细胞数量锐减,分布松散,细胞体积大小不一,形态不规则,失去原有特点,胞体皱缩,细胞间隙增大,部分细胞失去贴壁能力而浮起,折光性降低,细胞活力差。
2. MTT方法检测PPP对骨肉瘤细胞U-2OS增殖的影响,PPP浓度设为0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、8.0μM,并分别处理24h、48h、72h。结果显示,PPP可显著地抑制骨肉瘤U-2OS细胞的增殖,且随着药物浓度的升高和作用时间的延长,骨肉瘤细胞U-2OS的增殖抑制率随之明显增加（P<0.05）。药物相同作用时间条件下,0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、8.0μM各组两两间的比较表明,F24h=208.580、F48h=395.674、F72h=412.220,P24h、48h、72h=0.000;相同药物浓度下,24h、48h和72h各组间的比较表明,F0.5=40.825、F1.0=22.038、F2.0=91.701、F4.0=69.781、F8.0=22.999,P值均<0.01;同时药物浓度与作用时间之间有交互作用,F=13.471,P=0.000。
总之,实验结果表明,PPP能明显抑制人骨肉瘤细胞U-2OS的体外增殖,呈时间和浓度依赖性。
3.流式细胞术分析:0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、6.0μM的PPP处理骨肉瘤U-2OS细胞24h,细胞周期发生显著变化,G2/M期细胞数量明显增加,S期细胞减少,且周期阻滞作用呈明显的浓度依赖性（P<0.01）。这一结果说明,PPP阻滞了人骨肉瘤U-2OS细胞S期、G2→M期的过渡,即在PPP作用下,说明同时存在DNA合成、复制和有丝分裂障碍,通过影响细胞周期从而达到抑制细胞增殖的目的。
参考文献
[1]EMT transcription factors:implication in osteosarcoma[J].Guoqiong Yang,Jian Yuan,Kanghua Li.Medical Oncology.2013(4)
[2]EMT in developmental morphogenesis[J].Yukiko Nakaya,Guojun Sheng.Cancer Letters.2013
[3]Prognostic value of cancer stem cells,epithelial-mesenchymal transitionand circulating tumor cells in lung cancer[J].G.Pirozzi,V.Tirino,R.Camerlingo,A.La Rocca,N.Martucci,G.Scognamiglio,R.Franco,M.Cantile,N.Normanno,G.Rocco.Oncology Reports.2013(5)
[4]TGF-βsignaling and epithelial–mesenchymal transition in cancer progression[J].Yoko Katsuno,Samy Lamouille,Rik Derynck.Current Opinion in Oncology.2013(1)
[5]刘力.IGF-1R抑制剂PPP对人骨肉瘤细胞U-2OS的影响及其机制的研究[D].暨南大学,2015.